TALEN基因敲除/敲入鼠

- 服务报价: 面议
- 服务周期: 面议
- 服务商: 赛业生物科技
- 地 区: 广东省,广州市,萝岗区
- 发布日期: 2015-06-15
- 关键词:
应用领域:
服务简介:
TALEN(Transc服务内容、特点:
制作原理
TALEN(Transcription Activator-Like Effector Nuclease) 技术是基于对DNA识别的TALEN臂和人工改造的核酸内切酶的切割域(FokⅠ)的结合对细胞基因组进行修饰而实现的。TALEN的DNA识别域是由一些非常保守的重复氨基酸序列模块组成,每个模块由34个氨基酸组成,其中第12和13位的氨基酸种类为可变的(RVDs),且决定了该模块识别靶向位点的特异性。通过DNA识别域结合到靶位点上,以及FokI的切割域形成二聚体后,可特异性对目标基因DNA实现切断。在非同源末端连接修复过程中,DNA双链断开后会由于碱基的随机增减造成目标基因功能缺失。 该技术目前已成功应用于植物、细胞、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类模式动物的研究领域。
服务流程和周期
TALEN技术流程图
TALEN由四部分组成:N端序列,RVD,C端序列,FokI。利用Type II 限制性内切酶可以将RVDs模块分别生成不同的粘性末端,同时又不留有酶切位点, 通过一系列的相应酶切连接反应实现RVDs与TALEN骨架的无缝连接。
TALEN系统利用FokI的内切酶活性打断目标基因。FokI形成二聚体发挥活性,在TALEN结合臂的引导下,发挥特异性内切酶活性,在两个靶位点之间剪切DNA,形成DSB(Double- Strand Breaks),诱发DNA损伤修复机制。细胞通过NHEJ(Non- homologous End Joining)修复DNA,在此修饰过程中导致删除或插入了一定数目(非3的倍数)的碱基,造成移码,形成对目标基因特异性KO的突变体。
TALEN技术特点
1、可以应用于大小鼠,无动物品系限制;
2、修饰效率可达90%以上;
3、实验周期短、价格低。
服务类型
1、全身性基因敲除
2、双/多基因敲除
建系原则与流程
1、TALEN技术获得的基因敲除鼠,由于是在大鼠或者小鼠的鼠原核受精卵期进行的修饰,获得的F0鼠一般也是杂合子,并且每只FO鼠由于移码突变情况可能不一样,所以每只F0鼠也需要作为一个独立的谱系进行传代;
2、原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子鼠,F0代杂合子鼠与野生型鼠进行交配,获得测序鉴定阳性的F1代杂合子鼠(可能有多种突变类型的F1);
3、选择来自同一只F0代鼠,突变类型一致的F1代鼠,达到性成熟后与进行同胞交配,可获得F2代鼠。对交配获得的F2代鼠进行PCR及测序鉴定,理论上, F2代鼠中25%为相同突变型的纯合子鼠,有50%为只有一条染色体突变的杂合子鼠,有25%为野生型鼠。
运输条件:
常温需要的实验材料及资料:
小鼠技术联系人姓名:
王小姐技术联系电话:
020-28069022技术电子邮箱:
sunnywang@cyagen.comEGFPTg/+转基因小鼠:
EGFP转基因小鼠的启动子为beta-Actin,表达方式为全身表达,可以直接在激发光下看到荧光,但在早期研究中也有指在毛发以及血液中无荧光。
EGFP基因构建在pCAGGS载体上,该载体具有鸡β-actin启动子、CMV增强子, β-actin内含子以及牛球蛋白polyA信号。
Nestin-GFPTg/+转基因小鼠:
Nestin-GFP转基因小鼠的供体胚胎为C57BL/6和B6D2F1杂交后代,与C57BL/6品系回交得到该后代,启动子为Nestin,并含第二内含子,可促进神经管以及祖细胞中的蛋白表达。
该GFP基因的表达受nestin基因的调控,nestin基因是神经干细胞或者神经系统祖细胞表达的一种中间丝,在神经上皮细胞,放射状神经胶质等可观察到GFP的表达;新生鼠(7天)小脑,海马齿状回及嗅系统中可以观察到GFP表达,成年鼠中仅在海马齿状回及嗅系统中可以观察到,在小脑中没有观察到相应的荧光。即在具有神经形成的部位可以观察到GFP。
该转基因小鼠可以用于显示动物活体的神经性城区域,跟踪新生神经元的迁移和分化。
制作原理
制作转基因鼠最常用的一种方法是DNA原核显微注射。DNA原核显微注射是指将外源DNA通过显微注射的方法注射到受精卵的原核内,注射DNA整合到大(小)鼠受精卵的基因组中,并稳定遗传给后代。服务流程和周期
动物品系
C57BL/6小鼠:目前公布的小鼠基因组测序结果来源于C57BL/6小鼠品系。该品系小鼠模型已广泛应用于肿瘤、免疫、遗传学等方面的研究, 并已成为发表文章的首选小鼠品系。
FVB小鼠:原核大、清晰、近交品系,基因型比较单一;具有易于原核注射的优点。
SD大鼠:适合用于研究心血管、神经系统等器官发育的常用模式动物品系。转基因大(小)鼠类型
1、过表达转基因大(小)鼠
构建上述常规的带有启动子和目的基因的表达载体, 利用原核显微注射的方法将表达载体注射到小鼠受精卵中。通过构建广泛性/组织特异性/诱导性等不同的启动子,实现转基因在小鼠组织广泛性/特异性/特定条件下等的表达,达到对目的基因功能的研究目的。
2、RNAi转基因大(小)鼠
通常采用U6/H1驱动shRNA表达,设计靶序列构建shRNA载体,利用原核显微注射的方法将shRNA载体注射到受精卵中。在基因表达的过程中,通过shRNAi的干扰作用,达到对目的基因表达的沉默抑制,实现基因功能的研究。
3、microRNA转基因大(小)鼠
构建上述两种microRNA过表达和下调载体,通过原核显微注射将载体注射到受精卵中,通过基因表达,实现microRNA过表达或者下调。
4、可诱导性/组织特异性转基因大(小)鼠
将构建的广泛表达启动子-lox-stop-lox-转基因载体通过显微注射制备组织特异性转基因大(小)鼠模型,转基因在正常情况下并不表达, 只有与相应的组织特异性表达Cre/CreERT2小鼠杂交后,因Stop终止序列在特定的组织中被去除,从而达到转基因在诱导性/特定组织中特异性表达的目的。
5、BAC转基因大(小)鼠
Bacterial artificial chromosomes(BACs)是处理大片段DNA的重要工具。由于其完整性和保真度,可以更好的解释转基因的重要功能。因此,为了研究完整的时空特异性基因表达、基因结构及调控元件等,可以将BAC直接进行原核显微注射(约几十到几百Kb)或者将其改造后注射在小鼠或大鼠的受精卵中,以获得转基因鼠。
建系原则与流程
1、原核显微注射导入的目的基因是将目的基因随机整合到小鼠或者大鼠的基因组,因此首代转基因鼠(F0)将会有不同的整合位点。整合基因的拷贝数可能在不同的首代转基因鼠中也不同。因此,每只F0代鼠需要作为一个独立的谱系研究,并且与其它F0代鼠分开进行繁殖。由于外源基因一般只整合在二倍体动物的其中一条染色体上,属于半合子,其后代只有一部分个体带有整合的基因,需要进行筛选鉴定。
2、 原核显微注射获得PCR阳性F0代杂合子鼠。
3、 F0代鼠达到性成熟后(8周)与野生型鼠进行交配,获得F1代鼠。
4、 对交配获得的F1代鼠进行基因型鉴定,理论上,F1代鼠中有50%为转基因杂合子鼠,50%为野生型鼠。
注意事项:
1)每只F0代鼠基因型都不一样,不能进行F0之间的自交,只能先与野生型交配,筛选出基因型一致的F1。(假如F0代有多个位点的外源基于整合,F1还有可能有多种基因型)。
2) 获得F1鼠后,可以进行蛋白表达鉴定,优先筛选出表达的鼠后再进行后续的传代和保种。
制作原理
CRISPR/Cas9(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)是最新出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。 CRISPR 是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。在这一系统中,crRNA(CRISPR-derived RNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activating RNA)结合形成双链RNA,此tracrRNA/crRNA二元复合体指导Cas9蛋白在crRNA引导序列靶定位点剪切双链DNA达到对基因组DNA进行修饰的目的。CRISPR/Cas9系统能够对小鼠和大鼠基因组特定基因位点进行精确编辑, 目前已经成功应用于大小鼠基因的KO/KI模型制备。
服务流程和周期
CRISPR/Cas9流程图
Cas9结合gRNA,gRNA 的长度约为80个核苷酸,包含两个区域:gRNA 5' 端前20个核苷酸对应于靶标DNA,能 结合在靶DNA 上的约60个核苷酸(gRNA 长度取决于表达gRNA 的质粒)形成一个发夹结构,这个结构能帮助 gRNA 与Cas9结合,并由此指导与DNA 的结合。
通过gRNA上的靶点序列,在目标基因组上找到靶点序列,并揭开双螺旋,Cas9将剪切DNA双链,造成DNA双链断裂。Cas9使用简单,可满足多个靶点同时操作。CRISPR/Cas9技术特点
1、可实现对靶基因多个位点或多个基因同时敲除;
2、实验周期短,价格低;
3、可应用于大、小鼠等,无物种限制。
服务类型
1、全身性基因敲除
2、双/多基因敲除
建系原则与流程
1、CRISPR/Cas9技术获得的基因敲除鼠,由于是在大鼠或者小鼠的鼠原核受精卵期进行的修饰,获得的F0鼠一般也是杂合子,并且每只FO鼠由于移码突变情况可能不一样,所以每只F0鼠也需要作为一个独立的谱系进行传代;
2、原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代杂合子鼠,F0代杂合子鼠与野生型鼠进行交配,获得测序鉴定阳性的F1代杂合子鼠(可能有多种突变类型的F1);
3、选择来自同一只F0代鼠,突变类型一致的F1代鼠,达到性成熟后与进行同胞交配,可获得F2代鼠。对交配获得的F2代鼠进行PCR及测序鉴定,理论上, F2代鼠中25%为相同突变型的纯合子鼠,有50%为只有一条染色体突变的杂合子鼠,有25%为野生型鼠。
制作原理
传统的基因打靶技术制备基因敲除(Knock out)/敲入(Knock in)小鼠是建立在DNA同源重组与胚胎干细胞等技术基础上的分子生物学技术。
同源重组是指当外源DNA片段与宿主基因组片段同源性高时,同源DNA区部分可与宿主DNA的相应片段发生交换(即同源重组)。
基因打靶就是通过同源重组技术将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点,以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的。基因打靶技术目前已被广泛认为是一种理想的特定修饰与改造生物体遗传物质的最佳方法。尤其是条件性和诱导性基因打靶系统的建立,使得对基因在时间和空间上的靶位修饰更加明确、效果更加精确可靠,该技术的发展已经为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供了一个全新的、强有力的研究和治疗手段,并已显示出巨大的应用前景及商业价值。
服务流程
服务周期
小鼠品系
ES细胞品系:C57BL/6N(black)、C57BL/6N(agouti)、129(agouti)
基因打靶常用小鼠模型
3、基因敲入小鼠
4、人源化小鼠
制作原理:
基因打靶技术专利TetraOneTM KO,是采用独特的建系和基因改造技术建立了具有遗传优势的TetraOneTM ES细胞系,通过胚胎发育前期的显微注射,使TetraOneTM ES细胞100%代替内源ES细胞,实现跨越“嵌合体”阶段从而一步直接获得TetraOneTM小鼠的基因打靶专利技术。TetraOneTM小鼠的特征均与传统ES打靶技术产生的F1代小鼠一致。
服务流程和周期:
TetraOneTM KO技术特点:
1. 周期短,仅需6个月;
2. 脱靶效应低。
适用范围:
1. 完全性基因敲除
2. 条件性基因敲除
3. 定点基因敲入
传统ES打靶、TALEN和CRISPR/Cas9是基因组编辑的三大技术及主要工具。新一代核酸酶基因编辑技术TALEN和CRISPR/Cas9作为现代分子生物学技术上的一次革新,它结合了转基因技术简便快速,没有物种限制及ES细胞基因打靶技术精准的优点,在短短的几年时间里便受到广大科研人员的青睐。但由于其脱靶效应至今无法避免,且难以胜任大片段的基因敲入,所以还远远谈不上成熟。如何提高TALEN和CRISPR/Cas9的效率和降低脱靶效应将是未来的主要研究方向。
基于同源重组的ES打靶是基因敲除的业内金标准,它通过同源重组技术将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点,以达到定点修饰改造基因组某一基因的目的。基因打靶技术目前已被广泛认为是一种理想的特定修饰与改造生物体遗传物质的最佳方法。尤其是条件性和诱导性基因打靶系统的建立,使得对基因在时间和空间上的靶位修饰更加明确、效果更加精确可靠。尽管如此,漫长的构建周期(需时8-12个月)却使很多研究者望而却步。
很明显,TALEN、CIRSPR/Cas9和传统ES打靶基因敲除技术有着互补的作用,而TetraOneTM KO技术却是两者优势的结合。这在目前基因组编辑的技术研究中,无疑是最为值得关注的新一代革命性技术。它使更加快速精准构建基因打靶小鼠成为可能。
赛业生物科技采用独特的建系和基因改造技术建立了具有遗传优势的TetraOneTM ES细胞系,通过在胚胎发育前期进行显微注射,使TetraOneTM ES细胞100%代替内源ES细胞,实现跨越"嵌合体"阶段从而一步直接获得TetraOneTM小鼠的基因打靶专利技术。实验结果显示,TetraOneTM小鼠的特征均与传统ES打靶技术产生的F1代小鼠一致。